首页 > 技术支持 > 多肽设计简介

多肽设计简介

鸿肽生物在多肽领域多年深耕,积累经验,在多肽设计方面,我们分以下几个方面给出我们的建议:
多肽应用介绍
随着生物技术已经生物工程科技的发展,多肽的应用越来越广泛,通常,多肽的应用有:

粗品多肽

药物传递

抗体生产

药物发现

疫苗研发

组织工程

核磁研究

蛋白相互作用研究

酶分析研究

siRNA传递研究

磷酸化抗体

非商品化抗体

抗菌药物

癌症药物研究(GPCR激动剂)

糖尿病药物研究(GIP and GLP-1激动剂)

神经退化疾病药物

艾滋病疫苗研发

癌症疫苗研发

流感疫苗研发

人乳头瘤病毒疫苗研发

水凝胶研究

干细胞研究

伤口愈合研究

多肽设计基本原则

多肽设计基本因素 I:电荷

电荷的影响:

溶解性

多肽活性

对盐的结合能力

电荷取决于电离基团:

N端氨基,C端羧基

侧链R基,如Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys, Arg

解性关系的关键因素:pH/pI:

pH= pI: 溶解度最低,沉淀

pH< pI: 净正电荷

pH> pI: 净负电荷

成盐关系的关键因素:

Lys, His, Arg容易跟TFA, AcOH, HCl结合

Lys, Arg容易结合水分子

多肽设计的基本原则II:疏水性

疏水多肽的特性为:

长度>5个氨基酸

序列包含50%以上的疏水氨基酸

解决办法:将非必须的疏水氨基酸替换为带电氨基酸或者极性氨基酸

多肽设计的基本原则III:多肽长度

如果抛开多肽合成的过程,但从设计的角度来说,可以设计任意长的多肽,但是由于多肽固相合成的特点,长度越长,多肽合成的难度越大,合成出来的多肽的纯度越低,副产物也越多,纯化难度增大,往往会导致多肽在合成阶段就失败了,因此实验也无从进行,一般来说,多肽长度在15-20个氨基酸是适中的,长度在30个氨基酸以内的多肽基本都可以正常合成,如果超过40个氨基酸的多肽,合成成功率会下降很多。

多肽设计的基本原则IV:多肽纯度选择

一般来说,相同序列和修饰、相同数量的多肽会因为其纯度的不同而价格各异,纯度越高,单位质量的多肽价格也越高。鸿肽生物可以提供粗品、脱盐,70%到99%不同纯度级别的多肽供客户按需选择使用。 各种多肽纯度及应用范围如下:

应用领域

大规模功能性筛选

肽微阵列

作为制备抗体的抗原

层析法

酶联免疫吸附试验检测抗血清滴度

免疫印迹法(非定量)

酶底物肽(非定量)

封闭肽(非定量)

亲和纯化

磷酸化检测

蛋白电泳的应用和免疫细胞化学

标准酶联免疫吸附试验和RIA(定量)

受体配体相互作用(定量)

体内、体外 生物学测定

酶的研究和阻断实验(定量)

NMR研究

质谱分析

其他定量检测

SAR研究

临床试验

APIs(药物活性成分)

工业品

X-ray晶体研究

其他敏感的实验:酶与底物、受体与配体相互作其他定量检测

对应建议纯度

粗品多肽

>70%和>75%的多肽

>80%,>85%和>90%的多肽

>95%的多肽

>98%的多肽

多肽设计高级策略:多肽稳定性影响因素

在多肽化学合成的过程中容易导致的多肽不稳定及解决方案:

  • 不稳定的原因
    容易产生这种不稳定的序列或者氨基酸
    解决方案
  • 形成环化
    含有Asp-Gly
    N端为Gln
    将Asp替代为其他氨基酸
    将N端Gln乙酰化
  • 形成二级结构
    含有连续多个Glu, Ile, Leu, Phe, Thr, Tyr, Val
    Asp代替Glu
    Ser代替Thr
    Pro或者Gly代替每个重复的第三个氨基酸
  • 氧化
    含有Cys,Met
    Ser代替Cys
    Nle代替Met
  • 水解
    含有Asp-Gly或者Asp-Pro或者Asp-Ser
    用其他氨基酸来代替Asp
  • 产生颜色
    含有Trp
    用其他氨基酸代替Trp

外肽酶或者内肽酶导致的多肽不稳定及解决方案:

  • 外肽酶(例如氨肽酶,carboxypeptidases): 多肽对外肽酶的稳定性与多肽N-端氨基酸有相关性:
    长半衰期氨基酸: Met, Ser, Ala, Thr, Val, or Gly;
    短半衰期氨基酸:Phe, Leu, Asp, Lys, or Arg;

  • 内肽酶(如胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,胰肽酶E)
    对内肽酶敏感的多肽特征为:富Pro, Glu, Ser和Thr区域;

  • 降低降解的策略: 环化,N端乙酰化,C端酰胺化,使用D型氨基酸替换对应氨基酸,拟肽,订书肽成环。

肾清除对多肽的影响及解决方案:

肾清除的特征:1) <25 kDa的亲水多肽很容易被肾小球快速过滤清除;2)多肽不容易被肾小管被重新吸收。
降低肾清除的策略:将多肽偶联到大分子或者聚合物上如:聚乙二醇(PEG),多聚唾液酸(PSA),羟乙基淀粉(HES),牛血清白蛋白(BSA),脂肽修饰等。

肽分析失败的原因

肽分析失败的原因通常为:1)氧化;2)多肽溶解性差;3)不适当的存储条件;4)TFA平衡离子污染;5)生物污染;

1)氧化

氧化的症状:

经过一段时间多肽活性降低或者消失;

多肽颜色发生改变,从白色变为黄色,棕黄色或者棕色。

容易氧化的多肽:包含Cys, Trp, Met氨基酸的序列。

预防措施:

设计优化:使用Ser代替Cys,使用Nle代替Met。

多肽存储保护:将多肽分装(可以避免反复分装);将多肽用氩气保护并将多肽储存于密闭容器中。

多肽分析时保护:添加还原剂(抗氧化剂):DTT, TCEP, β-mercaptoethanol;使用氩气保护缓冲液;在无氧室中使用充氩水置换缓冲液和多肽;在无氧环境中进行分析。

2)多肽溶解性差

多肽溶解性差的症状:

多肽溶解后浑浊或者有沉淀

多肽溶解性差的序列:序列长度>5AA且包含Trp, Phe, Tyr, Met, Ile, Leu, Val超过50%的多肽序列。

多肽溶解性差的解决办法:

溶解的时候遵循溶解指南;

合成多肽的时候要求做溶解性测试;

使用极性或者带电荷氨基酸替代非必要疏水氨基酸;

引入O-酰基基团(如PEG);

引入亲水性Linker(如:Lys-Lys-Lys-Lys);

对于肽库可以进行移码;

3)不适当的存储条件

多肽存储不当的症状:

经过一段时间多肽活性降低或者消失;

冻干多肽从粉末状转变为晶体状;

容易受影响序列:包含Ser,Thr,Lys,Gly,Arg氨基酸的多肽序列。

解决办法:

将多肽分装(可以避免反复分装);

将多肽存储于-20℃避光干燥处;

避免反复冻融;

多肽操作过程中””和”不要”:

对于所有多肽

对于包含Cys, Met, 或者Trp的多肽

对于包含Asp, Glu, Lys, Arg, 或者His的多肽

对于必须保存于溶液中的多肽

根据实验需求实现分装;

避免反复冻融;

不要长时间以溶液形式保存多肽;

不要反复打开存储多肽的管子;

尽量避免将多肽暴露于空气;

尽量用氩气或者氮气保护多肽或者缓冲液;

用密封性好的容器保存多肽;

尽量避免将多肽暴露于空气;

将多肽保存于干燥皿器中;

用密封性好的容器保存多肽;

避免反复冻融;

根据日常实验需求将多肽溶液一次分装好;

用无菌溶剂溶解多肽;

用0.2 μm的滤膜过滤去除多肽中的细菌污染;

4)TFA平衡离子污染

TFA平衡离子污染症状:

不稳定的细胞或者组织活性以及酶分析结果;

IR图谱结果;

质谱响应降低;

多肽降解;

容易产生TFA平衡离子污染的序列:所有的序列,特别是包含带有正电荷的氨基酸Lys, His, Arg的多肽序列。

解决办法:

选择TFA去除服务或者脱盐处理;

5)生物污染

生物污染症状:

内毒素污染;

产生不需要的免疫反应;

容易产生生物污染的序列:所有的序列。

解决办法:

选用内毒素去除服务;

在无菌罩中打开多肽容器;